CRISPR 잠금을 해제하는 DNA 조립 키트

2023년 8월 30일 특집

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작성자: Thamarasee Jeewandara, Phys.org

클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복(CRISPR)과 Crispr 관련 단백질 9(CRISPR/Cas9)는 이제 미생물 세포를 조작하는 잘 알려진 혁신적인 방법입니다.

CRISPR의 주요 장점은 염색체 통합을 촉진하여 마커가 없는 DNA의 조립을 가능하게 하는 균주 설계에 있습니다. 이러한 편집 시스템은 매우 유익합니다. 그러나 조립이 간단하지 않으며 사용 및 적용이 어려울 수 있습니다.

Nature Communications Biology의 새로운 보고서에서 Tigran V. Yuzbashev와 연구팀은 CRISPR 기술에 더 쉽게 접근하고 구현할 수 있도록 설계된 기존 Cas9 툴킷의 한계를 확인했습니다. 그들은 세 가지 서로 다른 잘 확립된 방법을 논의하고 이를 결합하여 CRISPR/Cas9를 사용하여 효율적인 대사 공학을 위한 포괄적인 툴킷을 구성했습니다.

실험실에서 호모겐티스산을 구축하기 위해 137개의 프로모터 라이브러리를 생성하고 특성화하기 위한 147개의 플라스미드로 구성된 단일 툴킷입니다.

CRISPR/Cas9 시스템은 빠르고 정확하며 흉터 없는 게놈 변형을 제공하여 생물생산을 위한 미생물 균주를 설계하는 데 상당한 범위를 제공할 수 있습니다. 예를 들어 효모의 대사 공학은 화학 물질, 연료, 식품 및 의약품의 지속적인 생산을 위한 생물학 공학에서 빠르게 성장하는 분야를 제공합니다.

효모는 진핵 세포와 같은 대사 잠재력을 갖고 있으므로 대규모로 설계하고 배양하기가 더 쉽습니다. 결과적으로 생명공학자들은 효모용 CRISPR 시스템을 설계하고 개발했습니다.

높은 효율성으로 인해 CRISPR은 마커 없는 게놈 변형을 허용합니다. 이 작업에서 Yuzbashev는 효모 엔지니어링을 위한 CRISPR/Cas9 시스템의 세 가지 개선 사항을 식별하여 균주 최적화를 보장하고 대사 엔지니어링 프로젝트를 촉진했습니다. 방법에는 1) 마커와 마커 없는 변형 간의 쉬운 교환, 2) 다양한 통합 위치를 결정하기 위한 상동성 암의 빠른 교환, 3) gRNA를 복제하는 쉬운 방법이 포함되었습니다.

CRISPR 기반 마커 없는 통합을 활성화하기 위해 팀은 Cas9에 의해 유도된 이중 가닥 절단을 선택했으며, 세포 증식을 달성하려면 이를 복구해야 했습니다. 과학자들은 통합 없이 상동성 재조합 또는 비상동성 말단 결합(NHEJ)을 통해 통합된 템플릿 또는 기증자를 사용하여 이를 가능하게 했습니다. 비상동성 말단 연결 과정은 빵 효모인 Saccharomyces cerevisiae를 포함한 대부분의 곰팡이 종에서 관찰됩니다.

NHEJ 메커니즘이 우세한 종에서 연구팀은 NHEJ 유전자를 삭제하여 상동성 재조합을 강화했습니다. 마커 없는 방법이 성공하지 못한 경우, 과학자들은 이후 CRISPR-Cas9 지원 통합을 개선하여 마커 기반 통합으로 쉽게 되돌리는 것을 목표로 합니다.

Cas9 지원 통합에는 일반적으로 두 개의 상동성 암이 측면에 있는 통합 카세트로 구성된 기증자 템플릿이 필요합니다. 팀은 CRISPR/Cas9의 이상적인 통합이 단순화된 골든 게이트 조립 반응을 통해 사전 평가된 Cas9 기증자 구성에서 상동성 팔을 교환해야 한다는 이론을 세웠습니다.

또한, 프로모터는 관심 있는 제품으로 흐름을 방향 전환하는 모든 대사 공학 프로젝트의 핵심 요소입니다. Yuzbashevet al. 산업용 효모 Yarrowia liplytica를 사용하여 고효율 및 다용성을 위해 유전자 편집과 DNA 조립 전략을 결합한 대사 공학 툴킷을 개발했습니다.